Evde Kendi DNA’nızı Dizilemek
(bradleywoolf.com)- Kişisel ekipmanla genom dizilemesi yapmak isteyenler için yanak hücresi toplamadan VCF analizine kadar uzanan gerçek bir ev laboratuvarı süreci ve gerekli ekipman tek akışta özetleniyor
- Deney örneği olarak kullanılan yanağın iç kısmındaki hücreleri elde etmek kolaydır; ancak kanser tanısı ya da belirli bir dokudaki inflamasyon ve gen ekspresyonu analizi gibi doku bağlamı gerektiren sorular için uygun değildir
- Genom verisinin değeri, hemen tanı almaktan çok VCF’yi sorgulanabilir bir referans katmanına dönüştürüp VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector, Claude gibi araçlarla varyantları keşfetmekte yatıyor
- Hazırlık yaklaşık iki ay sürdü ve yalnızca MinION yaklaşık 7.500 dolar olduğundan, ekipman, reaktifler, sarf malzemeleri ve analiz ortamı da düşünüldüğünde ortalama bir birey için maliyet engeli hâlâ yüksek
- Düşük girdili, düşük kapsamlı bir çalıştırma tıbbi düzeyde yorumlama değil, teknik doğrulama olarak görülmeli; düşük kapsamdaki varyantları aşırı yorumlamamak önemli
Evde DNA dizilemenin kapsamı ve sınırları
- Kendi genomunu Oxford Nanopore Technologies MinION ile 5 kez dizileme deneyimine dayanıyor
- Yanağın iç kısmındaki hücreler pamuklu çubukla toplandı
- Dizileme için örnek olarak hazırlandı
- Dizileyiciye yüklendi
- Sonuç verileri analiz edildi
- Yanak hücreleri kolay elde edilir ve hızla yenilenir; ancak her biyolojik soru için uygun değildir
- Kanser tanısı için kullanılmaz
- İnflamasyon tanısı ya da vücudun başka bölgelerinde aktifleşen genleri saptamak için uygun değildir
- Göğüsteki ürtiker bölgesindeki inflamatuvar hücrelerde ifade edilen genleri görmek için sorunlu hücrelerle normal hücreleri karşılaştırmak gerekir
- Tüm hazırlık yaklaşık iki ay sürdü ve maliyet hâlâ ortalama bir bireyin erişmesini zorlaştıran düzeyde
- Maliyetler düşüyor
- Uzun vadede, telefonlar veya yapay zeka gibi DNA ve RNA ekspresyonunu gerçek zamanlı bildiren teknolojilerin mümkün olacağı düşünülüyor
Genom verisiyle neler yapılabilir
- Genom “sihir” değil, referans katmanıdır; elinizde VCF varsa çeşitli araçlarla sorgulanabilir
- Kullanılabilecek araçlar VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector, Claude vb.dir
- VCF temel alınarak şu sorular araştırılabilir
- Hangi varyantlara sahipsiniz
- Hangi genler ve yolaklar etkileniyor
- Hangi ilaçları farklı metabolize edebilirsiniz
- Hangi nadir varyantları ciddiye almak gerekir
- Modelin henüz bilmediği alanlar nerede
- Üretilen bilgi henüz tanı düzeyinde değildir
- “Yapay zeka söyledi, o halde CRISPR ile kendinizi düzenleyin” türü bir sonuç da değildir
- Yakın vadeli değer, statik genomu sorgulanabilir bir forma dönüştürmektedir
- DNA kararlı bir referanstır, RNA ise mevcut duruma daha yakındır; uzun vadede biyosensör verilerinin kişinin tek bir modelinde birleştirilebileceği düşünülüyor
Gerekli ekipman ve sarf malzemeleri
- Temel donanım Oxford Nanopore Technologies MinION olup fiyatı 7.500 dolardır
- MinKNOW çalıştıracak bir dizüstü bilgisayar veya iş istasyonu
- Çıktıları saklamak için 100 GB veya daha fazla depolama
- Dorado basecalling için GPU
- Vortex, heat block, santrifüj
- Başlıca sarf malzemeleri arasında ONT dizileme kiti, flow cell yıkama kiti, kontrol materyali, PBS ve yanak hücresi çubukları bulunur
- Reaktifler DNA ekstraksiyonu, kütüphane hazırlığı, flow cell priming ve kantifikasyon olarak ayrılır
- NEB Monarch HMW DNA Extraction Kit for Cells & Blood: 5 çalıştırma için 87 dolar
- NEBNext Companion Module v2: 24 reaksiyon için 760 dolar
- Oxford Nanopore SQK-LSK114: 6 reaksiyon için 720 dolar
- nuclease-free water, Qubit fluorometer, Qubit dsDNA BR veya HS Assay Kit
- Tezgâh ekipmanı ve plastik sarf malzemeleri ayrıca gereklidir
- microcentrifuge, magnetic rack, tube racks, ice bucket, -20°C freezer, 4°C fridge, pipettes
- sterile cheek swabs, LoBind tubes, PCR tubes, Qubit assay tubes, filtered tips, wide-bore P200 tips, gloves
Deney akışı: toplamadan nihai kütüphaneye
- Genel hedef, 2 yanak çubuğu örneğini MinION ile dizilenebilir bir kütüphaneye dönüştürmektir
- Hazırlık aşaması eldiven takmayı, tezgâhı temizlemeyi, tüpleri etiketlemeyi, AMPure XP beads’i oda sıcaklığına getirmeyi, enzimleri soğuk tutmayı, heat block’u 56°C’ye ayarlamayı ve ONT reaktiflerini kontrol etmeyi içerir
- Hücre toplama ve yoğunlaştırma akışı, yanağın iç kısmını 60 saniye kazıyıp PBS’ye koymak ve santrifüjle küçük beyaz veya gri-beyaz bir pellet elde etmekten oluşur
- PBS biraz bulanabilir
- Pellet’i aspire etmemek önemlidir
- Monarch kitiyle hücreler lizise uğratılır ve DNA capture beads’e bağlanır
- Lizisten sonra öncelik yüksek molekül ağırlıklı DNA’nın korunması olduğundan vortex kullanılmaz
- DNA bağlı beads kaybedilmemelidir
- gDNA Wash Buffer’a ethanol önceden eklenmiş olmalıdır
- Saflaştırılmış genomic DNA, Qubit ile kantifiye edilir
- 1x dsDNA High Sensitivity kullanılır
- Örnek konsantrasyonu çok düşükse yeni bir Qubit tüpünde daha fazla DNA ile yeniden ölçüm yapılır
- Mevcut tüpe yalnızca DNA eklemek assay hesaplamasını bozar
- Ara vermek için en uygun zaman DNA ekstraksiyonunun hemen sonrasıdır
- DNA LoBind tüpü açıkça etiketlenir
- Quick spin sonrası vortex yapmadan 4°C’de buzdolabında saklanır
Kütüphane hazırlığı ve flow cell’e yükleme
- İdeal repair/end-prep girdisi 47µL içinde 1.000ng DNAdır
- DNA çok seyreltikse ve 47µL’ye 1.000ng sığmıyorsa mümkün olan en yüksek hacim kullanılır
- İlk düşük girdili çalıştırma örneği 0,296ng/µL × 47µL ile yaklaşık 13,9ng idi; önerilen girdiden çok daha düşüktü ancak uçtan uca pratik için faydalıydı
- repair/end-prep için FFPE DNA Repair Buffer v2, FFPE DNA Repair Mix, N-Prep Enzyme Mix kullanılır
- Salt-T4 DNA Ligase bu aşamada değil, daha sonra kullanılır
- DCS kullanılmıyorsa optional 1µL DCS, nuclease-free water ile değiştirilir
- AMPure cleanup sonrası adapter ligation ile ONT dizileme adaptörleri eklenir
- Reaksiyona repaired/end-prepped DNA, LNB, Salt-T4 DNA Ligase ve LA girer
- LA çıkarılırsa dizilenebilir kütüphane oluşmaz
- Salt-T4 DNA Ligase çıkarılırsa adaptör ligasyonu başarısız olur
- LNB doğru karıştırılmazsa ligation chemistry kötüleşir
- Vortex, DNA shearing’e yol açabileceğinden kaçınılır
- Adapter-ligated library cleanup işleminde ethanol değil LFB kullanılır
- Pratik kural şudur: “Liquid moves. Beads stay.”
- Nihai kütüphaneye beads aktarılmaz
- Nihai kütüphane de Qubit ile yeniden kantifiye edilir
- Düşük girdili çalıştırmalarda değer düşük çıkabilir veya ölçüm başarısız olabilir
- Pratik çalıştırmada kütüphaneyi Qubit için tekrar tekrar tüketmek yerine 12µL library ile loading mix’e geçilebilir
MinION çalıştırması ve veri işleme
- MinKNOW’da flow cell kontrol edilir ve active pores kaydedilir
- 1200’den fazla: iyi
- 800–1200: kullanılabilir
- 500–800: sınırda veya pratik için
- 500’den az: kötü, ancak mekanik pratik mümkün
- 200’den az: yükleme pratiği dışında pratikte değeri düşük
- Son aşamada ele alınan tüpler üç tanedir
- Final library: adaptör cleanup sonrası DNA library
- Priming mix: flow cell hazırlığı için
- Loading mix: final library, sequencing buffer, library beads içerir
- Flow cell portları iki tanedir
- Priming port: sliding cover altında bulunur ve priming mix buraya girer
- SpotON sample port: küçük sample well’dir ve loading mix damla damla eklenir
- Final library flow cell’e doğrudan konmaz; önce loading mix tube’a eklenir
- MinKNOW varsayılan ayarları şöyledir
- Flow cell type: FLO-MIN114
- Kit: SQK-LSK114
- Basecalling: ON
- Model: High-accuracy / HAC
- Barcoding: OFF
- Alignment: OFF
- Adaptive sampling: OFF
- Raw reads / POD5: ON
- Filtering: düşük girdili pratik çalıştırmada OFF
- Düşük girdili pratik çalıştırmada live output iyi olmasa bile sonradan analiz edebilmek için raw POD5’i açık tutmak önerilir
Analiz pipeline’ı
- Gerekirse çalıştırma sonrası Dorado ile basecalling yapılır
dorado basecaller sup pod5_directory/ > calls.bam- Gerekirse
samtools fastq calls.bam > reads.fastqile FASTQ dönüşümü - Hızlı ilk kontrol için SUP yerine HAC kullanılabilir
- Human reference için GRCh38 FASTA kullanılır
- minimap2 ile reference index oluşturulur
map-ontile read’ler hizalanır- samtools ile BAM index ve flagstat oluşturulur, mosdepth ile coverage kontrol edilir
- Varyant çağırma için Clair3 ve ONT modeli kullanılır
- Çıktıda VCF bulunmalıdır
- Düşük coverage varyantları aşırı yorumlanmaz
- İlk MinION çalıştırması tıbbi düzeyde yorumlama değil, teknik doğrulama olarak ele alınır
- Annotation için VEP kurularak VCF, GRCh38 temelinde açıklamalı hâle getirilir
- ClinVar, gnomAD, PharmGKB eklenir
- Nihai tabloda chromosome, position, ref, alt, gene, consequence, ClinVar significance, gnomAD frequency, genotype, read depth, variant quality bulunur
Kaynaklar
- Seth Howes protocol: evde genom dizileme maliyeti ve protokolü için kaynak
- Quantifying Life: çok hafife alınmış bir kaynak olarak tanıtılıyor
- Integrated Drug Discovery Technologies: kaynak kitap olarak tanıtılıyor
1 yorum
Hacker News yorumları
Evde kendi başıma dizileme yapmak istemiyorum ama tüm ham veriyi veren bir üçüncü taraf hizmetiyle denemek isterim
Avrupa’da yaşayan sıradan bir tüketiciyim; hangi hizmeti kullanmam gerektiğine dair öneri duymak isterim. Verileri şirkette saklamıyorlarsa bu büyük bir artı olurdu ama o kadarını talep edip edemeyeceğimden emin değilim
23andMe sızıntısı için bkz.: https://en.wikipedia.org/wiki/23andMe_data_leak
Talep edilirse yüksek çözünürlüklü tüm genom dizilemesi de yapıyorlar. Ancak uzun sürüyor ve gecikmelerden şikâyet ederseniz siparişi iptal etme haklarını saklı tuttuklarını söylüyorlar. En ucuz seçenek değil ama Avrupalıların mahremiyet beklentileri açısından bence oldukça iyi. Mahremiyet ne kadar önemliyse, biraz “uğraştırıcı” bir şirket bazen o kadar iyi olabilir
Kendisi bunu çeşitli ülkelerde bizzat yapmış ama insanların ona unvanı yüzünden mi yardım ettiğini hâlâ bilmiyorum. Yine de, sıradan bir yazılım mühendisi olsanız bile yardım edecek birini bulabileceğinizden emindi. Yakınlarda bir araştırma enstitüsü varsa denemeye değer
Başlıca seçme nedenim o sırada 30 avroluk düşük fiyatlı bir ürünlerinin olmasıydı
Uzun okumaya ihtiyaç duymamın nedeni, aradığım bilginin neredeyse aynı olan tekrar eden genlerde bulunması. Dante Labs’tan aldığım FASTQ ve BAM dosyalarım var ama istediğim bilgiyi oradan çıkaramadım
“Bu, yapay zekanın okuyabilmesi için hazırlanmış bir belge; URL’yi kopyalayıp ChatGPT’ye yapıştırın ve yönlendirme alın. AR gözlüğünüz varsa yapay zeka tüm protokol boyunca size rehberlik edebilir, bu daha da iyi olur” kısmının nasıl bir büyü olduğunu anlamadım
Tabii doğrudan kendiniz de okuyabilirsiniz ama içerik oldukça yoğun
Kanalizasyondan kökleri çıkarıp, gerekirse dizilemeyle bunun hangi bitki olduğunu tespit eden ve kanalizasyon çökmeye başlamadan önce neyin öldürülmesi gerektiğini söyleyen bir şirket fikrini düşünmüştüm
Eğer birkaç yıl boyunca 10.000 dolarlık kanalizasyon hattı değişimini erteletebiliyorsa, 100 dolar ödeyecek çok insan olur gibi geliyor
https://www.envirodna.com/
https://www.naturemetrics.com/species-detection
https://www.ednacollab.org/industry/
https://wilderlab.co/
Bu şirketler çevresel DNA üzerine odaklanıyor. Bazıları daha çok yerel yönetim izleme işlerine yakınken, bazıları bireysel müşterilere de hitap ediyor
Bunun neden gerekli olduğunu tam anlamıyorum. Belirli bir bitkiyi öldürme yöntemi, orada bulunabilecek tüm bitkilere yönelik bir yöntemden ne kadar daha iyi olabilir? Çeşitli herbisit uygulamaları birleştirilebilir gibi görünüyor; bu seçenekler bu hizmetin maliyetinden daha ucuz olmaz mı?
Gerçekten zekice bir fikir ve koşullar uygunsa kesinlikle para verebilirim
Ama düşününce, gidere biyobozunur geniş spektrumlu bir herbisit dökmek aynı etkiyi daha ucuza sağlamaz mı?
Yeterince fazla insanın bu hizmetten haberdar olup sipariş vermesini sağlamak için nasıl bir yaklaşım izleneceğini merak ediyorum. Bu bana asgari uygulanabilir bir iş fırsatını düşündürüyor
Bir tesisatçının kapıyı çalması bile 100 doların altında zor. Acaba 500 doları mı kastediyordunuz, yoksa 100 dolar sadece laboratuvar analizi kısmı mıydı?
Sonuçlara dair bir tartışma olmasını isterdim. Bu sensör ve süreç hakkında daha önceki raporların değerlendirmeleri oldukça karışıktı
Sürecin kendisi havalı ama gerçek dünya koşullarından çıkan sonuçların ne kadar işe yarar olduğunu bilmek isterim
https://www.the-odin.com/whole-genome-sequencing-30x/
Hızlı ve nispeten ucuz yapmak için 599 dolarlık bir seçenek var
7.500 doların üzerinde garantili mahremiyet elde edebilirsiniz. Diğer özellikler yorumlarda söylendiği gibi değişebilir ama en azından veri evin dışına çıkmaz
Sekanslama yapmak istiyorum ama hiçbir şirketin, devletin ya da dini kuruluşun verilerime erişmesini istemiyorum.
Yazar, “Elinizde VCF varsa bunu VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector, Claude gibi araçlarda çalıştırabilirsiniz” dediğinde, verilerim tam da kaçınmak istediğim aktörlerin eline geçmiş olmuyor mu?
Öte yandan Claude’a veri vermek gerçekten de veriyi paylaşmak anlamına gelir. Ama bu adım zorunlu değil. Standart bir pipeline çalıştırırsanız genom varyantlarını içeren bir VCF dosyası elde edersiniz ve her varyanta anotasyon ekleyebilirsiniz. Anotasyon eklenmiş genlere bakarak varyantın patojenik mi, muhtemelen patojenik mi, düşük patojeniteye sahip mi yoksa benign mi olduğunu değerlendirebilirsiniz.
Avuç içi kadar bir nesneyle böyle şeyler yapılabilmesi gerçekten inanılmaz. Benzer boyutta bir CRISPR cihazı da çıkarsa iş artık Gattaca konusuna döner, orada durmak gerek gibi.
Islak laboratuvarda DNA toplama ve sekanslama deneyimim var ama neredeyse 20 yıl öncesine ait; o zaman da bu iş zordu ve çok sık başarısız oluyordu. Özellikle son derece temiz bir ortam yoksa başarısızlık oranı çok daha yüksek olur.
Veri ortaya çıktıktan sonra bile, toplama ortamını dikkate aldığınızda bunun ne kadar doğru olduğunu kendinize sormanız ve hesaba katılmamış korelasyonlu sekanslama hatalarına da bakmanız gerekir. Ayrıca genetik danışmanlık insanların gerçekten eğitim aldığı uzmanlık alanlarından biridir. Genetik verinin sizin için ne anlama geldiğini büyük bir dil modeline sormadan önce, veriyi bağlama oturtabilecek ve sizi ilgili uzmanlarla buluşturabilecek birine erişebilmeniz gerekir. Bu alanda doktora derecem olsa bile kendi verimi soğukkanlı ve akılcı biçimde yorumlayacağımdan emin değilim.
Ek olarak, neden Molecular Biology of the Cell bağlantısı 4 yıl önce çıkan 7. baskı yerine 6. baskıya verilmiş bilmiyorum. İlk üç baskının ortak yazarlarından biri ilk doktora dönemimde danışmanıydı; Roger Penrose’un E. coli kemotaksisinde mikrotübüllerin önemli olduğuna dair fikrinin tamamen saçmalık olduğunu gösteren kişiydi. Harika bir insandı. 2007’de ticari açıdan hâlâ çok erken aşamada olan Illumina verilerini analiz etmiştim ve referans genoma hizalayabildiğim için belirli yanlılıkları tespit edebilmiştim. Nanopore teknolojisinde bu tür yanlılıkların daha da fazla olması muhtemel; bunları hesaba katma beceriniz yoksa ciddi sorun yaşayabilirsiniz.
Bunu bir biyokimya yüksek lisansı olarak söylüyorum.
Kişisel genom şirketleri yerine, laboratuvarlara yönelik sekanslama dış kaynak hizmeti veren bir şirkete yaptırmak da bir yöntem olabilir. Yorumlamanın riskleri konusunda ise tamamen katılıyorum.
Mahremiyet konusuna dikkat edilmiş olmasını beğendim. “Claude’da çalıştırmak” gibi bariz sorunu bir kenara koyarsak, bahsedilen analiz araçlarından kaç tanesinin tamamen açık kaynak olduğunu ya da en azından yerelde çalıştırılabildiğini merak ediyorum.
Keşke yazıda bu kısım da ele alınsaydı.
Elime geçen sonucun gerçekten doğru mu yoksa sadece çöp mü olduğunu nasıl anlayacağım?