$2,000'ın altında DNA'nızı nasıl dizilersiniz

 (maxlangenkamp.substack.com)
1 puan yazan GN⁺ 2025-10-20 | 1 yorum | WhatsApp'ta paylaş
  • DNA dizileme maliyetinin, Moore Yasası'nın düşüş hızından daha hızlı azaldığı görülüyor
  • Oxford Nanopore MinION ile yaklaşık 1.100 $ ile evde DNA dizilemesi yapılabiliyor
  • Gerçek deneyde kan alımı, DNA izolasyonu ve nanopore ile dizileme gibi adımlar takip edildi
  • Sonuç olarak insan genomunun yalnızca yaklaşık %13'ü kapsandı; kirlenme, ekipman hatası gibi etkenler nedeniyle analizler sınırlı kaldı
  • Buna rağmen, uygun maliyetle doğrudan DNA'nın bir kısmını dizileyerek anlamlı bir deneyim elde edildi

Giriş

  • DNA dizileme maliyetinin hızla düşmesi sayesinde, geçmişte 2.3 milyar dolara ve 13 yıla mal olan insan genomunun okunması şimdi yalnızca Oxford Nanopore (yaklaşık 1,000 $) cihazıyla 48 saat içinde kendi başına yapılabilir hale geldi
  • Eskiden örnekler, güvenilir olmayan üçüncü taraf bir servise gönderilmek zorundayken bu yazıda, doğrudan ve laboratuvarı olmayan bir ortamda dizileme denendi

DNA Dizileme Süreci Genel Bakış

  • Amaç, 10 ml kandan A, C, G, T'den oluşan insan genom dizisini (yaklaşık 3 milyar baz) elde etmek
  • Toplam adımların özeti
    • Kan alımı
    • Kanın içinden insan DNA'sını izolasyonu
    • İzole edilen DNA'nın elektriksel yöntemle Oxford Nanopore cihazından geçirilerek her bir bazın okunması

DNA Dizilemenin Kısa Tarihi

  • Sanger dönemi (1960-2003): analog tabanlı, manuel işleme dayalı, çok yavaş ilerleyen bir yaklaşım
    • Hatalı nükleotidler kullanılarak DNA çoğalması durdurulur, parçalar elektriksel olarak ayrıldıktan sonra barkod gibi okunur
    • İnsan genomunun çözümlemesi 13 yıl ve 2.3 milyar dolar sürmüştü
  • Illumina dönemi (2005-2010'lar): paralelleştirme ve otomasyon
    • Sentetik yaklaşımın dizilemeye dâhil edilmesi, hız ve verimliliği büyük ölçüde artırdı
  • Tek molekül dizileme dönemi:
    • DNA bazları doğrudan elektriksel nanoporluğun içinde okunur, parçalanmaya gerek kalmaz
    • Bu deneyde de bu yöntem kullanıldı

Gerekli Ekipman ve Maliyet

  • Oxford Nanopore MinION Starter Kit (1,000 $): USB tabanlı dizileyici, flow hücresi ve hazırlık kimyasalları dâhil
  • Zymo DNA izolasyon kiti (ücretsiz örnek)
  • Mini santrifüj (Amazon, 50 $)
  • Laboratuvar sarf malzemeleri (eppendorf tüpleri, lancet, pipet vb., 50 $)
  • Toplam yaklaşık 1.100 $

Deney Adımlarının Ayrıntıları

Adım 1: Kan Alımı

  • Yaklaşık 200㎕ (0,2 ml) kan gerekiyordu; küçük bir lancetle bu miktar alınamadığı için parmak tekrarlı iğneleme ile kana erişildi

Adım 2: DNA İzolasyonu

  • Kanın büyük kısmı DNA içermeyen kırmızı kan hücreleri gibi kirleticilerden oluşur
  • DNA yalnızca beyaz kan hücrelerinden izole edilir; Zymo kitindeki enzimler ve santrifüj filtresiyle bu işlem yapıldı
  • Nanopore hazırlık kitinin adaptör ekleme adımları da uygulandı

Adım 3: Nanopore ile Dizileme

  • Hazırlanan DNA, MinION'ın küçük portuna enjekte edildikten sonra USB ile bağlandı
  • MinKNOW yazılımı gerçek zamanlı basecalling yapar ve elektriksel sinyalleri sinir ağı algoritmalarıyla A, T, C, G olarak tahmin eder

Sonuçlar ve Sınırlamalar

  • Toplamda yaklaşık 1 gigabazlık veri iki kez dizilenebildi (bu, yaklaşık 3 milyar bazlık insan genomunun yaklaşık %13'üdür)
  • İlk deneme donanım arızası nedeniyle durduruldu; flow hücresi arızası (2048 porenin sadece 623'ünün çalışır olduğu) yaşandı
  • Verinin %25'inde bakteri vb. kirlenme tespit edildi
  • SNP (tek nükleotid polimorfizmi) analizi için çoklu tekrarlar şartken, çoğu dizinin yalnızca tek okumayla kalması nedeniyle kapsam düşüktü
  • Buna rağmen 1,100 $ gibi düşük maliyetle insan genomunun bir kısmını anlamlı biçimde dizileyebilme deneyimi elde edildi

Teşekkür

  • Bu deneyde birlikte olan arkadaşlarına teşekkür eder

İlgili okumalar

1 yorum

 
GN⁺ 2025-10-20
Hacker News görüşü

  • Henüz "nanopore dizileme çağına" girdiğimizi söylemek zor; hâlâ sentez tabanlı dizileme ana akım konumunda

    • Genomu kesip küçük parçalara ayırmak ve sonra bunları referansa göre yeniden birleştirmek gerekiyor; bu süreçte çeşitli sorunlar ortaya çıkıyor
    • Nanopore dizilemede hata oranı yüksek olduğu için klinik uygulamalarda hâlâ sentez tabanlı yöntemler kullanılıyor (özellikle Illumina son 10 yılda teknolojik olarak çok güçlüydü)
    • Yine de nanopore cihazları küçük ve ucuz olduğu için cazip; hata oranı tekrar dizilemeyle bir ölçüde telafi edilebiliyor
    • Sentez tabanlı teknolojiyle güvenilir bir sağlayıcı üzerinden, tüm genomu 30x kapsama ile 1000 euro veya doların altında diziletmek mümkün; 180 dolarlık örnekler de gördüm ama ne kadar güvenilir olduklarından emin değilim
    • Tüm insan genomu için nanopore hâlâ erken olabilir, ama plazmid dizileme gibi kullanım alanlarında şimdiden çok faydalı
      • Sektörden biri olmasam bile üniversiteye sadece tüpü bırakıp ertesi sabah e-postayla 15 dolara sonucu alabiliyorum; bunların hepsi nanopore tabanlı iş akışı sayesinde
    • Hata oranı tekrar dizilemeyle telafi edilebilir ama bazen hatalar birbiriyle korelasyonlu olabiliyor
    • Genel olarak kısa okuma dizilemesi çok daha maliyet verimli; bizim startup da Illumina ile hücre hattı QC yapıyor ve sadece 260 dolara mal oluyor
    • Dizileme yöntemi hedefe göre değişir; NAO'da atık sudaki çeşitli virüsleri tespit etmek için Illumina'nın büyük flow cell'lerini (25B) ucuza kullanıyoruz
      • Ama nazal sürüntü gibi hedef virüs yükünün yüksek olduğu durumlarda, uzun okuma boyu ve düşük run cost nedeniyle nanopore daha uygun oluyor
    • Kısa okumaya yönelik klinik dizileme zaten yeterince iyi durumda, bu yüzden nanopore'un bunun yerini alması için bir neden yok
    • Klinik uygulamaların geleceği orta-büyük ölçekli varyant tespitinde; bu alan henüz tam aydınlatılmadığı için nanopore araştırmada ve nadir hastalık tanısında çok kullanılıyor
    • SBS (sentez tabanlı dizileme) son derece güvenilir, ama pazar payı büyük diye teknolojik ilerleme durmuş değil
      • Dizilemedeki yenilikler ML, RNA-DNA eşzamanlı analizi, uzun/kısa okumaların birleştirilmesi gibi alanlarda yaşanıyor
    • Aslında tanı laboratuvarlarında da nanopore teknolojisi giderek daha fazla kullanılıyor; hazırlık süreci daha ucuz ve qPCR düzeyinde hassasiyet de verebiliyor
      • Ayrıca metilasyon gibi daha çeşitli bilgiler de sunuyor
      • Yakın zamanda nanopore ile akut lösemi sınıflandırması yapan bir makale de çıktı makalenin aslı
      • Süre biraz abartılmış olsa da, tanıda önemli olan "işe yaraması"

  • Bu fikir (makale) ilgimi çekti ama cihaz sorunları ve ilk denemeden sonra hemen vazgeçilmesi yüzünden biraz hayal kırıklığına uğradım

    • Flow cell'de baştan çalışır durumda sadece 623 pore olduğu söyleniyor; bunun normalde de yaşanıp yaşanmadığını merak ediyorum, daha düzgün yapılmış başka denemeler bulmak isterim
    • Ben de gerçekten benzer bir şey denedim; kan yerine tükürük kullandım ve DNA'yı Qiagen kitiyle çıkardım
      • Benim nanopore flow cell'imde neredeyse tüm pore'lar düzgün çalıştı; muhtemelen makaledeki örnek depolama yöntemi sorunluydu
    • Aktif pore sayısı kullanım biçimine göre değişebilir; benim deneyimimde örnek hazırlığına bağlı olarak çok sayıda inaktif pore oluşabiliyor
      • Numune düzgün hazırlanmadıysa pore'lar tıkanabiliyor ya da aktivitesi düşebiliyor
      • Eskiden Oxford Nanopore verisi analiz ettiğimde, örnek hazırlama becerisine göre kalite o kadar değişiyordu ki hangi iş arkadaşının hazırladığını yalnızca veriden ayırt etmek mümkündü
      • Yazarların "garajda" hazırladığı örneklerin kalitesiz olduğunu tahmin ediyorum
      • Bu arada, arabadan güç alan mobil bir dizileme laboratuvarı kuran bir iş arkadaşım da vardı
      • Onun yaşadığı en büyük teknik darboğaz da örnek hazırlığıydı; hesaplama tarafı çok zor değildi
    • Az sayıda aktif pore olması "normal" denemez ama oldukça sık görülen bir durum
      • NGS çalışmaları sırasında edindiğim deneyime göre flow cell'lerin dörtte biri kusurluydu; ONT'nin de hücre kendi testini geçemezse değişim politikası vardı
    • Numuneye bağlı değişir ama genelde 1200'den fazla aktif pore normaldir ve en az 800 garanti edilir
      • O yüzden bu durumda geri ödeme istemeye değer
    • Bu örnek, "gerçekte denersen ne olur" sorusunu göstermesi açısından ilginçti
      • Genom soybilimiyle az da olsa ilgim var ve teknik sorunların çok olacağını zaten tahmin ediyordum

  • Nebula, Dante gibi şirketler yaklaşık 300 dolara 30x veya 100x kapsamalı tüm genom dizilemesi sunuyor

    • Aslında 1000 dolarlık genom dizileme 10 yıl önce zaten gerçekleşmişti
    • Nebula'ya bakmıştım; genom verilerini Meta, Microsoft ve Google'a aktardığı iddiasıyla toplu davayla karşı karşıya
      • Subreddit'lerde de kiti gönderip yıllarca sonuç alamayan çok sayıda örnek var
      • Dizileme kalitesi, DTC (doğrudan tüketiciye) genom verilerindeki yanlış pozitif oranları gibi sorunlar da var; 23andMe'de de benzer bir olay yaşandığı için genomumu özel bir şirkete göndermekte isteksizim
    • DanteLabs'te tüm genom dizilemenin en düşük fiyatı 399 euro (466 dolar) DanteLabs ürün bağlantısı
    • 2.000 dolarlık tutara DNA ekstraksiyon ekipmanı ve dizileyicinin kendisi de dahil; Nebula gibi şirketlerin kullandığı dizileyiciler muhtemelen 1 milyon doları aşan cihazlar
      • Daha ucuza getirmek isterseniz WGS yerine exome dizileme ya da duruma göre basit genotipleme de yapılabilir
      • Hatta 100 dolarlık WGS'yi sunan şirketler şimdiden var olabilir
    • Yine de özünde birisi (şirket) genom verilerimin sahipliğini elinde tutmuş oluyor
      • "Meşru ticari çıkar" bahanesiyle pek çok şey yapabilirler; o şirketin hacklenmesi veya satılması riski de zaten gerçek hayatta yaşandı
    • 1000 dolar denilen şey aslında "ölçek ekonomisi fiyatı"
      • Belli bir hacmin üzerinde toplu işleme yapılınca mümkün olan bir fiyat seviyesi

  • mynucleus.com üzerinden yanak sürüntüsüyle 500 dolara tüm genom dizilemesi yapılabiliyor (savraj10 koduyla %10 indirim)

    • Kan gerekmiyor, 2.000'den fazla hastalık riski sunuyor ve eşiniz de test olursa gelecekteki çocuklara dair tahminler de yapılabiliyor
    • Yakında yeni yatırım haberi açıklanacak; ham veri indirme desteği var ve SOC2 ile HIPAA güvenlik uyumluluğu da garanti ediliyor
    • Öte yandan, 23andMe'deki veri sızıntısı gibi bir durumda Nucleus iflas ederse genom verilerinin üçüncü taraflara satılmasını nasıl engelleyebileceklerini merak ediyorum
      • Ana sayfada veri gizliliği açısından fark yaratan bir yaklaşım pek görünmüyor
      • Nucleus da "veri satmıyoruz" diyor ama 23andMe de öyle diyordu
      • Gerçekte herhangi bir şirketin bu konuda tam güven vermesi zor
      • Sırf 3.000 dolar tasarruf edilecek diye genomunuzu Nucleus'a emanet etmek dikkatle düşünülmeli
    • Benim açımdan, kendi genomumu diziletmekten çok bunu üçüncü bir tarafa güvenerek vermek daha rahatsız edici
      • Makalede bahsedilen %13 kapsama ile herhangi bir genom analizi işe yaramaz; başlık abartılı
    • Ne kadar kapsama sağlandığını merak ediyorum
    • Eskiden inanılmaz pahalı ya da sıradan insanların erişemediği bir hizmetin şimdi 500 dolara sunulması şaşırtıcı
    • Monero ile ödeme kabul edip etmediklerini merak ediyorum

  • Ben Nebula'yı kullandım (şimdi yeniden markalandı ve daha pahalı oldu), ailemin genomlarını da dizilettim ve süreç oldukça kolaydı

    • "Lifetime" planıyla FASTQ dosyalarını R2 bucket'ta saklıyorum; Nebula 250 dolar ve aylık 50 dolarlık abonelik var ama hemen iptal edilebiliyor
    • VCF dosyamı burada görebilirsiniz
      • Belirli bir varyantı (rs104894396) analiz etmesi için bir LLM'e verebilir ya da SNPedia üzerinden bakabilirsiniz
    • Eşimle taşıyıcılık taraması da yaptırdık ama Nebula ile değil, başka bir yöntemle
      • İkimizde de GJB2 genine bağlı işitme kaybı varyantı olduğu görüldü; bu yüzden sağlıklı bir çocuğumuz olması için embriyoların da dizilemesini yaptırdık
    • Gerçek genom verisi örneği görmek isterseniz benim verilerimi test dosyası olarak kullanabilirsiniz (erkek olduğum için chrY varyantları da görülebilir)
    • Dante'yi de denedim ve iki şirketin sonuçlarını karşılaştırmak istemiştim
      • Dante, dizileri kullanıcıya bağlama biçimi nedeniyle kullanışsızdı (kodların ayrıca saklanması gerekiyor)
      • Sorularıma hiç yanıt gelmediği için nasıl çalıştıklarını öğrenemedim
    • Nanopore teknolojisi de gerçekten ilginç ama Twitter'da cihaz kalite kontrol sorunları olduğuna dair şeyler gördüm
      • Bir gün kızımın genomuyla birlikte karşılaştırmak isterim
    • İlginç bir ayrıntı olarak, sende CYP11B1 rs4541(g;a) var; meyan kökünden hoşlanmıyor olabilirsin
      • CYP17A1 −34 T>C, rs743572(A;G) de sende mevcut
      • Tüm gen kombinasyonuna bağlı olarak fiziksel veya davranışsal özellikler çeşitli şekillerde ortaya çıkabilir
      • Örneğin düşük vücut ağırlığı, anksiyete, ergenlikte akne, ayağa kalkınca baş dönmesi, tuz isteği, uyku bozuklukları gibi eğilimler olabilir
      • D vitamini, magnezyum ve B vitamini grubu eksikliğine yatkınlık olabilir; bunun sonucunda TMJ, kas krampları, miyopi gibi çeşitli fiziksel ve nörolojik belirtiler görülebilir
      • Belirli genlerden strateji masa oyunlarını sevme, solak olma olasılığı, zeka, uyku düzeni, görsel yetenek gibi çıkarımlar da yapılabiliyor
      • Ama böyle tekil gen varyantları bütün resmi açıklamak için yeterli değil; diyet ve yaşam tarzı konusunda mutlaka doktorla konuşmak gerekir (ben doktor değilim, biyoloji ve genomiği hobi olarak kurcalayan bir programcıyım)
    • Tüm DNA'nı kamuya açık paylaşma konusunda neden bu kadar rahat olduğunu gerçekten merak ediyorum

  • Ne yazık ki şu anda 1000 dolarlık MinION Starter Kit artık satılmıyor ve makaledeki bağlantı da 404 veriyor

    • Artık flow cell dahil MinION ürünleri 4950 dolardan başlıyor

  • DNA dizilemesi yaptıracaksam, ekipmanı satın alıp tamamen çevrimdışı şekilde bizzat yönetemeyeceksem bunu asla yapmam

    • Bu, yalnızca kendi genom bilgilerim için değil, gelecekteki soyum ve kan bağı bulunan herkes için de potansiyel risk anlamına geliyor
    • En kötü senaryonun ne kadar ciddi olabileceği tahmin edilenden de büyük
      • Üstelik epigenetik veri olmadan sağlık öngörüsü neredeyse yok denecek kadar az
      • Hatta kaygı veya nocebo etkisi nedeniyle sağlığa zarar bile verebilir
      • Gerçekte en fazla doktorun teşhisi doğrulamasına yardımcı olur ve bu yol daha güvenlidir

  • Elektrikli kettle ile PCR (thermocycler) yerine geçme fikri komikti

    • Tam da böyle, sıcak su kaplarını sırayla kullanarak DNA amplifikasyonu yapılan dönemler vardı
    • Kandan sadece beyaz kan hücrelerini ayıklayıp dizileselerdi sonuç daha iyi olabilirdi, ama kan lanseti ve küçük ekipmanla bu kolay değil
      • 2010'ların başında biyolojiye giriş laboratuvarında sıcak su banyolarını değiştirip yumurta zamanlayıcısıyla manuel PCR yapmıştım
      • Sonrasında gerçek bir thermocycler kullanınca cihazın kıymetini çok daha iyi anladım

  • Dizileme maliyetinin Moore Yasası'ndan bile daha hızlı düştüğünü gösteren grafiğin (2001~2015) sonrasına ait verileri görmek isterim

    • Sadece 2021'e kadar uzanan grafikler bulabiliyorum; 2015'ten sonra ilerleme sanki yavaşlamış gibi
    • Nanopore daha güvenilir hale gelirse yeniden devrimsel bir değişim olabilir
    • Grafik 2001'den başlıyor ama ben 90'ların ortasında EMBL'de ince film elektroforez dizileyicisi geliştirilmesine katılmıştım
      • O zamanlar günde birkaç yüz baz bile üst seviye sayılıyordu
    • Görünüşe göre NHGRI bu grafiği güncellemeyi sürdürüyordu ama 2022'den sonra bütçe sorunları nedeniyle durmuş olabilir
      • Dikkatlice bakınca 5 yıl içinde 100 dolarlık genom çağının gelmesi mümkün görünüyor

  • Dante ve Nebula'nın itibarı pek iyi değil, ySeq için de 8 ay beklemek gerekiyor

    • Bu makaledeki nanopore ekipmanı da düzgün çalışmıyor
    • 2025'te Avrupa'da kendi genomumu diziletmek pek kolay görünmüyor